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徠卡共聚焦課堂:激發(fā)篇

點(diǎn)擊次數(shù):743 更新時(shí)間:2023-06-12

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濾光片轉(zhuǎn)輪到聲光可調(diào)濾光器(AOTF)
熒光的激發(fā)需要特定顏色的光:既要有效地激發(fā)探針(波長接近探針激發(fā)光譜的最大值),又要留下足夠的空間收集發(fā)射光而不會進(jìn)入檢測器的光路中。在共聚焦顯微鏡中,通常使用多譜線激光器或激光電池作為激發(fā)光源,這需要設(shè)備既能夠自由選擇適合當(dāng)前實(shí)驗(yàn)所用熒光團(tuán)的激發(fā)譜線又能夠控制該激發(fā)譜線的強(qiáng)度因?yàn)橹苯釉诠庠刺幙刂茝?qiáng)度時(shí),大多數(shù)激光器會出現(xiàn)噪音增強(qiáng)的現(xiàn)象。AOTF(聲光可調(diào)濾光器)的引入簡化了濾光過程,同時(shí)顯著提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性。AOTF對于耦合白激光源是明智選擇。
濾光片轉(zhuǎn)輪-早期的濾光工具
共聚焦顯微鏡中熒光的激發(fā)光源是激光或不同顏色的激光組合。出于技術(shù)原因共聚焦選擇激光作為光源[2]。但是傳統(tǒng)激光器通常只發(fā)射一條或幾條單一波長的激光譜線(現(xiàn)代化解決方案是白光激光器[3])。然而,生物醫(yī)學(xué)成像所使用的熒光染料的激發(fā)光譜從近紫外到近紅外的都有。大多數(shù)情況下,為了同時(shí)檢測幾種不同熒光染料的發(fā)射情況,需要通過二向色鏡結(jié)合一系列激光譜線來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下,與在熒光照明中分離激發(fā)和發(fā)射光的“分光鏡"相比,反射鏡以反向模式使用。
由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對較窄,因此不建議直接通過激光功率控制強(qiáng)度。因此,需要一種設(shè)備來單獨(dú)減弱激光強(qiáng)度。同樣,如果關(guān)閉和打開光源次數(shù)過多,激光器壽命也會縮短。特別是氣體激光器,在關(guān)閉后仍處于高溫狀態(tài)而未冷卻時(shí),不適合馬上再次開啟。
“激光電池"滿足以上所有要求,它由一系列激光器(通常為3-5個(gè))組成。所有激光器均配有光閘,光閘由機(jī)電驅(qū)動并由軟件控制。所有激光器都需要一個(gè)用于減弱強(qiáng)度的伺服控制設(shè)備(一個(gè)帶有一系列灰度濾片濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊)多譜線激光器還需要另一個(gè)濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊,它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片,以便選擇單譜線或組合譜線。
顯然,整個(gè)設(shè)置可能會變得略微復(fù)雜低效,容易出現(xiàn)錯(cuò)位和漂移問題,可能在濾片選擇切換過程中引發(fā)機(jī)械振動。若改變激發(fā)方案,成像的效率將非常低下,由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數(shù)量有限,該設(shè)備靈活度不高。

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圖1:傳統(tǒng)的“激光電池"帶有5個(gè)激光管、5個(gè)機(jī)械光閘、8個(gè)光束組合鏡、5個(gè)衰減濾光片轉(zhuǎn)輪和1個(gè)用于多參數(shù)共聚焦顯微鏡的選擇激發(fā)譜線濾光片轉(zhuǎn)輪。
聲光可調(diào)濾光器-運(yùn)行方式
簡化機(jī)械設(shè)置并將靈活性提高幾個(gè)數(shù)量級的一個(gè)重要步驟是采用聲光可調(diào)濾光器(AOTF)。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個(gè)不同的方向的設(shè)備,而其余顏色的光直接通過 AOTF [1]。AOTF由晶體制成,通常是TeO2或SiO2或其他具有類似特性的化合物。晶體由機(jī)械轉(zhuǎn)換器在幾百兆赫范圍內(nèi)的機(jī)械波激發(fā)(聲光可調(diào)濾光器的“聲"是指機(jī)械波,盡管頻率不符合人耳可聽見聲音的頻率)。最重要的是所需光束偏轉(zhuǎn)的方向是固定的,不會隨光的顏色而改變。此外,方向的進(jìn)光量也可以通過機(jī)械波的振幅進(jìn)行控制。
激光電池發(fā)射出不同波長的激光譜線(準(zhǔn)直)后,AOTF可以選擇任意波長的譜線使之偏轉(zhuǎn)至所需方向,并可控制該譜線的能量。AOTF可以真正同時(shí)選擇多條譜線,譜線數(shù)量主要取決于采購設(shè)備具體情況。一個(gè)好的系統(tǒng)可同時(shí)提供8條譜線。
總而言之,AOTF用機(jī)械固定的單晶*取代了上述所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片,可以輕松實(shí)現(xiàn)任意譜線的組合;當(dāng)激光電池同時(shí)提供8條譜線時(shí),組合方式達(dá)到256種——這對于AOTF來說不是問題。另外:每條選定的譜線在強(qiáng)度上都是無級可控的。本質(zhì)上,AOTF是一個(gè)“8-通道激光調(diào)光器"。
工程師可能會認(rèn)為,AOTF將兩種偏振模式導(dǎo)向不同的方向。這是*正確的,并不損害概念。無論如何,激光都是偏振光,因此光將始終指向既定方向。垂直方向無激光,沒有任何指向。

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圖2:在以傳統(tǒng)激光電池為光源的共聚焦照明中,AOTF(右邊的方框)替換了所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片,任何進(jìn)入AOTF的譜線都可以得到抑制、衰減或*用于共聚焦顯微鏡。由激光器發(fā)射的任意譜線都可進(jìn)行組合(組合數(shù)量大但有限)。
 
AOTF-額外的好處

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圖3:用不同激光譜線或不同強(qiáng)度的同一條激光譜線掃描感興趣的區(qū)域。在激光譜線掃描期間,照明方式會根據(jù)預(yù)定義的模式在預(yù)設(shè)點(diǎn)發(fā)生變化。任何組合都是可能的,幾乎所有圖形都可以使用鼠標(biāo)在預(yù)掃描的圖像上繪制。當(dāng)然,也可應(yīng)用幾何圖案(矩形、圓形、橢圓形……)?!傲憔€"也是一種模式,常用于保護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)物中的背景細(xì)胞。
 
聲光分束器可在特定樣本中進(jìn)行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外,假設(shè)用兩種不同的熒光染料對標(biāo)本進(jìn)行染色,一種非常強(qiáng),另一種非常弱,而無級調(diào)諧通過調(diào)暗明亮染料的激發(fā)來檢測強(qiáng)度相似的兩種熒光,可以平衡熒光發(fā)射強(qiáng)度。因?yàn)锳OTF的控制速度很快,不需要停止掃描過程,所以很容易在成像過程中即時(shí)實(shí)現(xiàn), 
通過無級控制來平衡激發(fā)光強(qiáng)度,不僅有利于對比熒光通道,而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發(fā)射光譜出現(xiàn)“拖尾"現(xiàn)象,導(dǎo)致在成像的通道收集了錯(cuò)誤的信號。通過將激發(fā)降低,可以改善發(fā)射光譜的拆分(抑制串色)。
 
最后,選定譜線的波長(和強(qiáng)度)之間的切換在幾微秒內(nèi)完成,速度非???;相比之下,機(jī)械標(biāo)準(zhǔn)濾光片轉(zhuǎn)輪大約需要一秒鐘。這種快速切換使得在單條譜線的掃描期間可以改變激發(fā)方式(采用何種波長的譜線,這些譜線分別對應(yīng)多大強(qiáng)度)。此功能可在樣本上繪制用不同激發(fā)光激發(fā)的區(qū)域,即所謂的“感興趣區(qū)域",在這些區(qū)域中,不同的激光被激活用于成像。此外,無需采集信號的區(qū)域不會被照射,非常好地保護(hù)了樣本以供日后研究。本文開頭的圖片展示了這類感興趣區(qū)域,在單次掃描中應(yīng)用了5種不同的參數(shù)設(shè)置。
最后,如果選擇白激光器作為光源,AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色。在此情況下,聲光可調(diào)濾光器將白激光光源變成可調(diào)光源。


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