了解復(fù)雜且快速變化的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)是深入探索生物進(jìn)程的重要一步。因此，現(xiàn)代生命科學(xué)研究越來越需要關(guān)注于在分子水平上實(shí)時(shí)發(fā)生的生理事件。

 
 
觀察和分析活細(xì)胞時(shí)面臨的挑戰(zhàn)
在固定細(xì)胞或組織中，獲取樣品“分子狀態(tài)"的信息已是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。如果需要獲取實(shí)時(shí)信息，，就必須盡可能在實(shí)驗(yàn)過程中保證細(xì)胞自然地運(yùn)行生理機(jī)制，因此將加大實(shí)驗(yàn)的困難程度。此外，由于很多生理過程的持續(xù)時(shí)間僅有幾秒甚至幾毫秒（例如細(xì)胞內(nèi)離子水平的變化），必須在相對較短的時(shí)間內(nèi)采集大量信息。
滿足這些挑戰(zhàn)性需求的一種方法是采用被統(tǒng)稱為活細(xì)胞成像的光學(xué)技術(shù)?；罴?xì)胞成像可研究活細(xì)胞中的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)生理過程，而非提供細(xì)胞當(dāng)前狀態(tài)的一幅“快照"。它把快照轉(zhuǎn)變成了電影?；罴?xì)胞成像可提供單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)（原位）甚至整個(gè)生物體（體內(nèi)）中動(dòng)態(tài)發(fā)生分子事件的空間和時(shí)間信息。這些特性讓活細(xì)胞成像成為了研究細(xì)胞生物學(xué)、癌癥、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)中動(dòng)態(tài)生理過程的必要技術(shù)。
近年來，電子學(xué)、光學(xué)和生物化學(xué)的迅速發(fā)展，使得科學(xué)家們更輕松的實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像。如今的活細(xì)胞成像方法使用優(yōu)化的顯微鏡、專用光源、高速相機(jī)、高靈敏度探測器和特異性的熒光標(biāo)記物，可同時(shí)提供技術(shù)成熟且仍具有創(chuàng)新性的全套解決方案，滿足在分子水平上對單細(xì)胞或整個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行實(shí)時(shí)研究的挑戰(zhàn)性需求。
使用線粒體標(biāo)記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞成像

 
圖1：熒光鈣染料Fluo-4標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)。鈣染料的位置類似于表征細(xì)胞內(nèi)的鈣分布。

 
圖2：線粒體標(biāo)記物MitoRed®染色的睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

 
圖3：圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體的共定位情況。

 
圖4：睪丸支持細(xì)胞的DIC圖像。
 
使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞琛工業(yè)大學(xué)生物II研究所化學(xué)感知系Sophie Veitinger博士提供。（地址：德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)研究所）
對應(yīng)刊物（非圖片來源）：
 
活細(xì)胞成像中的常見問題
活細(xì)胞成像通常適用于培養(yǎng)的細(xì)胞系（例如HEK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞）、原代細(xì)胞（例如皮膚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）、急性制備的組織切片（例如腦切片）或整個(gè)器官或生物體。因?yàn)榧?xì)胞被帶出其原本“自然"的培養(yǎng)環(huán)境并會受到光毒性的影響，所以在實(shí)驗(yàn)過程中的首要任務(wù)是保持細(xì)胞的健康狀態(tài)。
 
細(xì)胞外溶液
不同類型的人工細(xì)胞外溶液（林格氏液、人工腦脊液(ACSF)）和培養(yǎng)基（例如Leibovitz L-15）用于為細(xì)胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)基成分包括從極簡單的“含鹽"溶液（例如林格氏液）到非常復(fù)雜的混合物（例如Leibovitz L-15），種類繁多。
但所有溶液都有一個(gè)共同點(diǎn)，即都包含pH緩沖液，因?yàn)楸┞对诃h(huán)境中之后，會顯著改變培養(yǎng)的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多細(xì)胞外溶液中，pH緩沖液通過添加10–20 mM兩性離子有機(jī)化學(xué)品HEPES（2-[4-1-基]乙磺酸）來實(shí)現(xiàn)。但對于很多細(xì)胞來說，細(xì)胞外溶液不能用HEPES或其他化學(xué)緩沖液（例如MOPS、TES），因?yàn)榕囵B(yǎng)基中缺乏pH緩沖碳酸氫鹽會對細(xì)胞造成傷害。要解決該問題，必須將二氧化碳輸送到細(xì)胞外溶液中（二氧化碳與細(xì)胞外溶液接觸時(shí)，會轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽）。這可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)：一種是不斷輸送氣態(tài)二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧氣和5%的二氧化碳）到細(xì)胞外溶液中，并不斷對細(xì)胞進(jìn)行換液。這種方法通常用于代謝周轉(zhuǎn)率高于細(xì)胞增殖的切片制備。
另一種常見的方法是將細(xì)胞保存在可調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境氣體濃度和溫度（在很多情況下）的培養(yǎng)室中。在此類培養(yǎng)物中持續(xù)供應(yīng)5-7%的二氧化碳?xì)怏w，并且可以嚴(yán)格控制溫度。必須根據(jù)使用的樣品類型和實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間，來確定化學(xué)緩沖的細(xì)胞外溶液是否足以使細(xì)胞保持良好狀態(tài)，或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養(yǎng)小室。在很多情況下，化學(xué)緩沖溶液即可滿足細(xì)胞培養(yǎng)和短時(shí)實(shí)驗(yàn)的要求。，因?yàn)榧毙郧衅x周轉(zhuǎn)率要高得多，通常需要足夠的二氧化碳供應(yīng)。但對于很多細(xì)胞類型和長時(shí)間成像實(shí)驗(yàn)，必須使用培養(yǎng)小室。
 
光毒性
使用熒光染料進(jìn)行活細(xì)胞成像的另一個(gè)問題是：激光或高強(qiáng)度電弧放電燈的入射光會損害細(xì)胞，即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發(fā)時(shí)發(fā)生。熒光染料被激發(fā)后，它們將與分子氧發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生自由基。為避免光毒性，必須選擇盡可能低的光強(qiáng)度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時(shí)間，以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，還必須考慮實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間。長時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，通常不需要高幀速率。因此，圖像采集的周期頻率通?？梢詮睦缑棵?0多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量，從而大幅降低光毒性。
對于低強(qiáng)度熒光信號成像，可以考慮更改圖像采集條件設(shè)置，比如在大多數(shù)情況下，通過將相機(jī)功能用作像素合并或提高增益，甚至使用特殊的高靈敏度相機(jī)（例如EM-CCD相機(jī)）進(jìn)行成像。這樣可以在不增加激發(fā)持續(xù)時(shí)間或光強(qiáng)度的情況下實(shí)現(xiàn)更好的信噪比和信號質(zhì)量，而這兩者都會導(dǎo)致更高的光毒性。此外，選擇具有長激發(fā)波長的熒光基團(tuán)也可降低光毒性，因?yàn)榕c具有短激發(fā)波長的熒光基團(tuán)相比，傳遞給樣品的能量更低。熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白(GFP)）的光敏位點(diǎn)位于被多肽包膜覆蓋的蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此通常沒有光毒性。
 
焦面漂移
此外，在長時(shí)間的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，很可能發(fā)生焦面漂移的問題，，?？梢允褂门鋫溆熊浖蛴布刂谱詣?dòng)對焦的成像儀器來避免這種情況。

 
圖5：接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以游離蛋白的形式大量表達(dá)（因此未融合于MP或CP），并且可以定位在受感染的表皮和葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。由荷蘭瓦赫寧根農(nóng)業(yè)大學(xué)，生物分子科學(xué)部門分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Joan Wellink博士及植物科學(xué)部門病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Jan van Lent博士提供。
 

 
視頻1：用DIOC6染色的活洋蔥球細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行透射光檢測；使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝，63倍物鏡，1.5倍變焦，2倍線平均，掃描分辨率512 x 265，速度每秒4.7幀。

 
視頻2：用表達(dá)GFP融合蛋白的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞。細(xì)胞溶質(zhì)蛋白在細(xì)胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm，14層切)每5秒記錄一次，，持續(xù)10分鐘。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素，雙向掃描，變焦2倍，物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細(xì)胞生物學(xué)研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用于活細(xì)胞成像的方法
可應(yīng)用于活細(xì)胞成像的寬場和共聚焦顯微技術(shù)的范圍也非常廣泛。通常，使用復(fù)式顯微鏡和反差對比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC）），隨時(shí)間觀察細(xì)胞的生長、聚集或運(yùn)動(dòng)過程。此外，通常使用體視顯微鏡或宏觀鏡對大型標(biāo)本（例如發(fā)育中的斑馬魚胚胎）進(jìn)行延時(shí)成像。在過去數(shù)十年中，先進(jìn)熒光技術(shù)變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應(yīng)用的迅速增加，使生物研究的視角從平面向三維立體轉(zhuǎn)變。