熒光壽命的概念

熒光壽命是熒光分子在激發(fā)態(tài)停留的時間，這個時間可以反映熒光分子的內(nèi)在屬性和所處的微環(huán)境，是一個很有用的工具。以往，熒光壽命的測量和計算是件非常復(fù)雜和耗時的工作，只有少數(shù)專業(yè)的科學(xué)家關(guān)注和使用該工具。最近幾年，隨著新技術(shù)的發(fā)展，熒光壽命數(shù)據(jù)的獲得越來越容易，也被更多的生命科學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家來利用熒光壽命進(jìn)行實驗設(shè)計德國馬普醫(yī)學(xué)研究所的Kai Johnsson研究組長期致力于開發(fā)新的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)，近期，他們利用熒光壽命來輔助開發(fā)新的蛋白標(biāo)記，在2021年4月在BioRxiv上刊發(fā)了題為“

HaloTag9: an engineered protein tag to improve fluorophore performance"的研究論文。

俗話說巧婦難為無米之炊，科學(xué)實驗第一步就是拿到好的材料。作者鎖定了常用的標(biāo)簽蛋白Halo7，將其改造成了壽命更長的Halo9。

Halo9的前世今生：

Halo7標(biāo)簽蛋白由于其分子量小、易于表達(dá)、無生物毒性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中。將Halo7標(biāo)簽蛋白與目的蛋白重組后，用帶有氯代烷烴的熒光配基與Halo蛋白發(fā)生脫鹵素反應(yīng)形成酰胺鍵共價結(jié)合，即可實現(xiàn)熒光配基對目的蛋白的標(biāo)記（圖1A和1B）。

該實驗室用點飽和突變的方式對Halo7進(jìn)行了改造，篩選得到的Halo9與熒光配基MaP618結(jié)合后，熒光強度較Halo7增加了近百分之四十。更為重要的是熒光壽命發(fā)生了改變，從3.1ns（HaloTag7-MaP618）提升到3.7ns（HaloTag9-MaP618）（圖1D）。

圖1 Halo標(biāo)簽蛋白工作原理及改造示意圖

材料拿到之后，我們看下作者是如何利用熒光壽命技術(shù)對這來之不易的材料玩出新花樣的吧。
花樣一：根據(jù)熒光壽命進(jìn)行光譜之外的拆分

Halo7與Halo9聯(lián)用實現(xiàn)單通道多色成像

作者構(gòu)建了H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系，使用MaP555-CA來同時標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9，用MaP555-Actin來標(biāo)記F-actin, 而MaP555-Actin與MaP555光譜相同，所以系統(tǒng)僅采用一個光譜通道完成圖像采集，再通過Phasor根據(jù)熒光壽命拆分出三個通道，分別是MaP555-CA-H2B-HaloTag7標(biāo)記的細(xì)胞核、MaP555-CA-Tommo20-HaloTag9標(biāo)記的線粒體和MaP555-Actin標(biāo)記的細(xì)胞骨架（圖2）。

這樣設(shè)計的優(yōu)勢在哪里呢？傳統(tǒng)的多色成像實驗根據(jù)光譜差異來設(shè)計，會有串色等限制，而且需要多次采集圖像，會造成樣品的光損傷。通過熒光壽命來進(jìn)行成像，僅需要拍攝一次就完成圖像采集，不僅減少了成像時間，而且降低了激光對樣品的損傷。

圖2 單通道三色熒光成像

綠色，H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核；紫色，Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體；藍(lán)色，MaP555-Actin標(biāo)記微絲。Halo7與Halo9配基均為MaP555-CA。Ex：550，Em：570-620。

花樣二：利用熒光壽命進(jìn)行超高分辨成像——TauSTED

H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功后，作者對該細(xì)胞做了STED超高分辨成像。由于只用了一個染料MaP555去同時標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9， STED成像時僅需要一次depletion過程就完成圖像采集。后期通過Phasor云圖將H2B和Tomm20的未受受激輻射的長壽命的光子分離出來，即得到背景更純凈的雙色STED圖像（圖3）。

圖3 單通道TauSTED雙色成像

第一行，共聚焦成像結(jié)果；第二行，TauSTED成像結(jié)果；第三行 ，共聚焦與TauSTED成像Phasor圖對比。綠色，H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核；紫色，Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體，配基均為MaP618-CA。Ex：615，Em：630-760。

技術(shù)盤點——TauSTED

STED技術(shù)通過一束環(huán)形的STED激光來干涉熒光衍射環(huán)的外圈發(fā)生受激輻射從而產(chǎn)生擦除效果，從而突破衍射極限實現(xiàn)超高分辨率成像。TauSTED技術(shù)創(chuàng)造性地將STED與熒光壽命技術(shù)結(jié)合，XY分辨率可達(dá)到30nm，獲得高分辨率的同時可顯著降低STED激光強度保護(hù)樣本。TauSTED特別適合應(yīng)用于組織和細(xì)胞內(nèi)微小結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的觀察，如膜蛋白與膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、蛋白復(fù)合物等。

圖4 TauSTED成像對比

從左往右，傳統(tǒng)共聚焦成像，2%STED激光強度傳統(tǒng)STED成像，2%STED激光強度TauSTED成像。

花樣三：利用熒光壽命技術(shù)改造Biosensor

Fucci（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator）是一種監(jiān)測細(xì)胞周期的biosensor。Fucci(CA) 將細(xì)胞周期依賴性的降解片段hCdt與hGem分別連接綠色和紅色熒光蛋白，根據(jù)得到的兩種熒光蛋白的強度比例來區(qū)分四種不同的細(xì)胞周期G1期、S期、G2期和M期。作者將此biosensor中的兩種熒光蛋白分別用HaloTag7和HaloTag9進(jìn)行置換，根據(jù)此兩種Tag熒光壽命的不同來指示細(xì)胞周期，構(gòu)建了基于熒光壽命成像的Fucci(CA) -LT。

作者使用TauSense工具測得HT7-hGem的AAT（Average photon arrival time，平均光子到達(dá)時間）較短，用于指示S期，HT9-hCdt的AAT較長，用于指示G1期，而G2和M期混雜了兩種成分，測得的AAT處于中間水平（圖5A）。由于HaloTag可以用不同的染料進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)ucci(CA)-LT構(gòu)建成功之后，實驗人員可以任意更換與HaloTag搭配的不同顏色的探針，靈活性更強。此外，作者還將TauSense測得的圖與FastFLIM測得的圖進(jìn)行了對比（圖5B），結(jié)果顯示兩種測量方法的一致性很高。對比基于光譜的Fucci（CA），基于熒光壽命的Fucci(CA)-LT只需要一個成像通道就完成實驗，光毒性較Fucci(CA)降低了一半，在長時間活細(xì)胞成像中更具有優(yōu)勢（視頻1）。

圖5 基于熒光壽命構(gòu)建Fucci（CA）biosensor，追蹤細(xì)胞周期

A，F(xiàn)ucci（CA）-LT工作原理示意；B，F(xiàn)ucci（CA）-LT 指示細(xì)胞周期，TauContrast與FastFLIM測量結(jié)果對比，無明顯差異。

視頻1 TauSense長時程（24小時）活細(xì)胞成像

技術(shù)盤點——TauSense
TauSense用平均光子到達(dá)時間（Average photon arrival time，AAT）來指示熒光壽命，使用簡單，方便快捷，不需要進(jìn)行參數(shù)調(diào)節(jié)，幫助您快速挖掘樣品熒光壽命信息。它包含三個子工具，TauContrast可以一鍵獲取樣品的熒光強度信息和壽命信息，用于監(jiān)測細(xì)胞周期變化、離子濃度的變化、組織的代謝變化等；TauGating根據(jù)AAT的長短來設(shè)置時間窗口，可以將樣品中短壽命的自發(fā)熒光、雜散光等去除掉；TauSeparation基于AAT的區(qū)別將檢測到的信號進(jìn)行拆分，即使所用的染料發(fā)射光譜*重合，TauSeparation也能將其拆分成多個通道。

圖6 用TauGating去除擬南芥葉片細(xì)胞壁自發(fā)熒光

左圖：普通模式成像；右圖：TauGating成像。紅色：葉綠體；綠色：線粒體；門控窗口：0.3-12ns。

圖7 TauSeparation技術(shù)用于NE-115細(xì)胞雙通道四色成像

左圖：灰色，NUC Red（細(xì)胞核）和SiR-tubulin（微管）；黃色，Act-mNeoGreen（微絲）和MitoTracker Green（線粒體），光譜兩兩串色不可拆分。右圖：藍(lán)色，NUC Red(細(xì)胞核);洋紅色，SiR-tublin(微管)；紅色，Act-mNeonGreen(微絲)；綠色，MitoTracker Green(線粒體)。

總結(jié)  
本論文通過改造HaloTag7得到了壽命更長的HaloTag9，HaloTag7與HaloTag9聯(lián)合使用，僅需要一種染料標(biāo)記即可實現(xiàn)多色成像。用此種方法進(jìn)行TauSTED成像時，可通過phasor將熒光壽命進(jìn)行拆分，一次depletion過程完成雙色STED成像，減少了光損傷。用此方法構(gòu)建的Fucci(CA)-LT biosensor監(jiān)測細(xì)胞周期，可以自由選擇熒光配基的種類，應(yīng)用更靈活。

科研小靈感：
標(biāo)簽蛋白何其多，biosensor何其多。選取一個切入點，開動腦筋改一改，熒光壽命技術(shù)用起來，說不定就成功了呢？

參考文獻(xiàn)

【1】Deo, C. et al. The HaloTag as a general scaffold for far-red tunable chemigenetic indicators. Nat. Chem. Biol. (2021). doi:10.1038/s41589-021-00775-w

【2】Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M. & Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.

Biophys. J. 94, L14–L16 (2008).

【3】Roberti, M. J.

et al. TauSense: a fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods (2020).

【4】Shirmanova, M. V et al. FUCCI-Red: a single-color cell cycle indicator for fluorescence lifetime imaging. Cell. Mol. Life Sci. (2021). doi:10.1007/s00018-020-03712-7